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TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白的纯化及其生物学活性鉴定

时间:2019-09-19  浏览次数:105  编辑:admin

目的: 用重组Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统大量表达融合蛋白TGF-βRⅡ/Fc, 并对其进行纯化及鉴定; 验证该融合蛋白是否能够阻断细胞因子TGF-β1的生物学作用.方法: 采用病毒空斑形成试验测定病毒滴度, 并对其进行扩增.采用Protein G 柱和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化目的蛋白.采用SDS-PAGE分析纯化后的目的蛋白, 并将蛋白电泳条带进行灰度扫描, 计算目的蛋白的含量.采用Western blot和夹心ELISA法, 鉴定目的蛋白是否表达.采用MTT比色法, 验证融合蛋白TGF-βRⅡ/Fc能否阻断TGF-β1对小鼠肺成纤维细胞(L929)生长的作用.采用Western blot技术, 验证融合蛋白能否阻断TGF-β1对L929细胞纤维黏连蛋白(FN)生成的促进作用.结果: 本实验室构建并保存的重组Bac-TRⅡ杆状病毒原液内病毒的滴度为2×1012 pfu/L.蛋白电泳后灰度扫描结果表明, 目的蛋白约占总蛋白的10%.夹心ELISA法和Western blot分析证明目的蛋白已表达.融合蛋白TGF-βRⅡ/Fc能够阻断TGF-β1对L929细胞生长的抑制作用, 以及对该细胞FN生成的促进作用.结论: 本室构建的重组Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统, 能够表达融合蛋白TGF-βRⅡ/Fc, 表达水平为9 mg/L.纯化得到的目的蛋白具有一定的生物学活性, 可阻断TGF-β1对L929细胞生长的抑制作用和对FN生成的促进作用, 为该蛋白的成批生产及在肺间质纤维化基因治疗中的应用奠定了基础.

 



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